為貫徹《中華人民共和國環(huán)境保護(hù)法》和《中華人民共和國水污染防治法》，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，保障人體健康，規(guī)范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定方法，我國生態(tài)環(huán)境部制定了本標(biāo)準(zhǔn)。下面優(yōu)爾普儀器就和大家分享一下該標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)布稿全文。
水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法
Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method
1 適用范圍
本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。
本標(biāo)準(zhǔn)適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定。
本方法的檢出限為10MPN/L。
2 規(guī)范性引用文件
本標(biāo)準(zhǔn)引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
GB/T 6682 分析實驗用水規(guī)格和實驗方法
GB/T 14581 水質(zhì) 湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ 494 水質(zhì) 采樣技術(shù)指導(dǎo)
HJ/T 91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范
3 術(shù)語和定義
下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。
3.1 總大腸菌群 total coliforms
37℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。
3.2 糞大腸菌群 fecal coliforms
又稱耐熱大腸菌群(thermotolerant coliforms)。44.5℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細(xì)菌。
3.3 大腸埃希氏菌 Escherichia coli
俗稱大腸桿菌。37℃培養(yǎng) 24 h，能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)生成黃色的鄰硝基苯酚，同時產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶(β-Glucuronidase)，分解選擇性培養(yǎng)基中的 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2(MUG)釋放出熒光物質(zhì)(4-甲基傘形酮)的腸桿菌科細(xì)菌。
3.4 最大可能數(shù) most probable number(MPN)
又稱稀釋培養(yǎng)計數(shù)，是一種基于泊松分布的間接計數(shù)法。利用統(tǒng)計學(xué)原理，根據(jù)一定體積不同稀釋度樣品經(jīng)培養(yǎng)后產(chǎn)生的目標(biāo)微生物陽性數(shù)，查表估算一定體積樣品中目標(biāo)微生物存在的數(shù)量(單位體積存在目標(biāo)微生物的最大可能數(shù))。
4 方法原理
在特定溫度下培養(yǎng)特定的時間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養(yǎng)基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)分解為黃色的鄰硝基苯酚(ONP);大腸埃希氏菌同時又能產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養(yǎng)基中的 4- 甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)分解為 4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產(chǎn)生熒光。統(tǒng)計陽性反應(yīng)出現(xiàn)數(shù)量，查 MPN 表，分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。
5 干擾和消除
5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)消除干擾。
5.2 重金屬離子具有細(xì)胞毒性，能破壞微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，可在樣品采集(8.1)時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)消除干擾。
6 試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標(biāo)準(zhǔn)的分析純試劑，實驗用水應(yīng)滿足 GB/T 6682中三級水的要求。
6.1 培養(yǎng)基。
本標(biāo)準(zhǔn)采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培養(yǎng)基。每100 ml樣品需使用培養(yǎng)基粉末2.7 g±0.5 g，所含基本成分如下：
培養(yǎng)基成分
也可采用市售商品化培養(yǎng)基制品。
6.2 硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)。
6.3 乙二胺四乙酸二鈉(C10H14N2O8Na2·2H2O)。
6.4 硫代硫酸鈉溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10 g/ml。
稱取 15.7 g 硫代硫酸鈉(6.2)，溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現(xiàn)配。
6.5 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。
稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉(6.3)，溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質(zhì)期為30d。
6.6 97 孔定量盤：含 49 個大孔，48 個小孔。其中，每個小孔可容納 0.186 ml 樣品，大孔中 48 個大孔每個可容納 1.86 ml 樣品，一個頂部大孔可容納 11 ml 樣品。也可采用經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌的市售商品化成品。
6.7 標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤。
6.8 無菌水：取適量實驗用水，經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。
7 儀器和設(shè)備
7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時，可采用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋。
7.2 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調(diào)。
7.3 恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
7.4 程控定量封口機：用于 97 孔定量盤(6.6)的封口。
立科程控定量封口機
7.5 紫外燈：365～366 nm。
7.6 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用計量合格的可調(diào)式移液器。
7.7 三角瓶：100 ml。
7.8 量筒：100 ml±1 ml。
7.9 一般實驗室常用儀器和設(shè)備。
注：三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗前按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，烘干，備用。
8 樣品
8.1 樣品采集
點位布設(shè)及采樣頻次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。
采集微生物樣品時，采樣瓶(7.1)不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。
采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面 10～15 cm 處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的 80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。
從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至最大，放水 3～5 min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約 3 min 滅菌或用 70%～75%的酒精對龍頭進(jìn)行消毒，開足龍頭，再放水 1 min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。
采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。
在同一采樣點進(jìn)行分層采樣時，應(yīng)自上而下進(jìn)行，以免不同層次的攪擾。
如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液(6.4)，以除去活性氯對細(xì)菌的抑制作用(每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液);如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液(6.5)，以消除干擾(每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液)。
注：15.7 mg 硫代硫酸鈉(6.2)可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調(diào)整。
8.2 樣品保存
采樣后應(yīng)在 2 h 內(nèi)檢測，否則，應(yīng) 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內(nèi)檢測。
9 分析步驟
9.1 樣品稀釋
根據(jù)樣品污染程度確定接種量(見表 1)，避免接種樣品培養(yǎng)后 97 孔定量盤(6.6)出現(xiàn)全部陽性或全部陰性。接種量小于 100 ml 時，應(yīng)稀釋樣品后接種，接種量為 10 ml 時，取 10 ml 樣品加入到盛有 90 ml 無菌水(6.8)的三角瓶(7.7)中混勻制成 1:10 的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。對于未知樣品，可選用多個接種量進(jìn)行檢測。
9.2 接種
量取 100 ml 樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入 2.7 g±0.5 g 培養(yǎng)基(6.1)粉末，充分混勻，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盤(6.6)內(nèi)，以手撫平 97 孔定量盤背面，趕除孔內(nèi)氣泡，然后用程控定量封口機(7.4)封口。觀察 97 孔定量盤顏色，若出現(xiàn)類似或深于標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤(6.7)的顏色，則需排查樣品、培養(yǎng)基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作。
注：9.1、9.2 步驟在野外操作時應(yīng)避開明顯局部污染源，建議使用一次性手套、口罩、酒精燈等。
9.3 培養(yǎng)
測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將封口后的 97 孔定量盤放入恒溫培養(yǎng)箱(7.3)中37℃±1℃下培養(yǎng) 24 h。
測定糞大腸菌群時，將封口后的 97 孔定量盤放入的恒溫培養(yǎng)箱中 44.5℃±0.5℃下培養(yǎng)24 h。
9.4 對照試驗
9.4.1 空白對照
每次試驗都要用無菌水(6.8)按照步驟 9.1～9.3 進(jìn)行實驗室空白測定。培養(yǎng)后的97孔定量盤不得有任何顏色反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)查明原因后重新測定。
9.4.2 陰性和陽性對照
總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表 2。
將標(biāo)準(zhǔn)菌株制成300～3000個/ml 的菌懸液，將菌懸液按接種(9.2)和培養(yǎng)(9.3)要求操作，陽性菌株應(yīng)呈現(xiàn)陽性反應(yīng);陰性菌株呈現(xiàn)陰性反應(yīng)，否則，該次樣品測定結(jié)果無效，應(yīng)重新測定。
注：可先制備較高濃度菌懸液，采用血球計數(shù)器在顯微鏡下對其濃度進(jìn)行初步測定，然后根據(jù)實際情況用無菌水(6.8)稀釋至 300～3000 個/ml。
9.4.3 結(jié)果判讀與計數(shù)
將培養(yǎng)24h后的97孔定量盤進(jìn)行結(jié)果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性;樣品變黃色且在紫外燈(7.5)照射下有藍(lán)色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽性。如果結(jié)果可疑，可延長培養(yǎng)至28h進(jìn)行結(jié)果判讀，超過 28 h 后出現(xiàn)的顏色反應(yīng)不作為陽性結(jié)果?？墒褂帽Ｙ|(zhì)期內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)陽性比色盤以輔助判讀，參見附錄 A。
分別記錄97孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數(shù)量。
10 結(jié)果計算與表示
10.1 結(jié)果計算
從97孔定量盤法MPN表中查得每100ml樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌的MPN值(置信區(qū)間參見附錄C)后，再根據(jù)樣品不同的稀釋度，按照公式(1)換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌濃度(MPN/L)：
大腸菌群濃度計算公式
10.2 結(jié)果表示
測定結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)測定結(jié)果≥100 MPN/L 時，以科學(xué)計數(shù)法表示;若 97孔均為陰性，可報告為總大腸菌群、糞大腸菌群數(shù)或大腸埃希氏菌未檢出或<10 MPN/L。
11 精密度和準(zhǔn)確度
11.1 精密度
6 個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為 6.0×100MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 4.0×10000 MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 9.0×10000000MPN/L)三個不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為 2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.26%～1.3%、0.65%～2.0%、1.3%～3.7%和 0.68%～2.8%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%;重復(fù)性限為 0.17、0.18、0.21 和 0.18;再現(xiàn)性限為 1.8、0.23、0.38 和 0.20;實驗室間置信區(qū)間見表 3。
6個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為70MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 9.0×1000MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 2.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為 2000MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.69%～1.9%、0.93%～2.9%、5.4%～21%和 1.8%～3.0%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 9.6%、1.6%、15%和 3.7%;重復(fù)性限為 0.23、0.21、0.58 和 0.19;再現(xiàn)性限為 1.7、0.26、0.90 和 0.35;實驗室間置信區(qū)間見表 4。
6個實驗室分別對低濃度(地下水，濃度均值為 1.0×100MPN/L)、中濃度(地表水，濃度均值為 1.3×10000MPN/L)和高濃度(生活污水，濃度均值為 3.0×1000000MPN/L)三個不同濃度細(xì)菌總數(shù)的樣品及有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(濃度為3700MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍分別為 0.40%～2.4%、1.3%～2.9%、3.4%～17%和 2.4%～9.2%;實驗室間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%;重復(fù)性限為 0.22、0.26、0.58 和 0.55;再現(xiàn)性限為 1.6、0.76、0.64 和 0.75;實驗室間置信區(qū)間見表 5。
11.2 準(zhǔn)確度
6家實驗室對總大腸菌群有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)的相對誤差范圍為-6.4%～-3.5%;相對誤差的最終值為-4.7%±1.2%。
6家實驗室對大腸埃希氏菌群標(biāo)準(zhǔn)樣品(2000 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)的相對誤差范圍為-15%～-6.3%;相對誤差的最終值為-13%±3.3%。
6家實驗室對糞大腸菌群的有證標(biāo)準(zhǔn)樣品(3700 MPN/L)進(jìn)行了 6 次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)的相對誤差范圍為-17%～-0.81%;相對誤差的最終值為-13%±6.1%。
注：微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測定結(jié)果全部經(jīng)以 10 為底對數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行計算。
12 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制
12.1 每批樣品按對照試驗(9.4)進(jìn)行空白對照測定，定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行陽性和陰性對照試驗。
12.2 每 20 個樣品或每批次樣品(≤20 個/批)測定一個平行雙樣。
12.3 對每批次培養(yǎng)基須使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基質(zhì)量檢驗。
12.4 定期使用有證標(biāo)準(zhǔn)菌株/標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行質(zhì)量控制。
13 廢物處理
實驗中產(chǎn)生的廢物經(jīng) 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min 后，作為一般廢物處理。
以上就是HJ1001-2018水質(zhì) 總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法發(fā)布稿標(biāo)準(zhǔn)的全部內(nèi)容了，有需要的朋友可以參考。
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